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　　本文利用RACE方法克隆得到了两种泥鳅SOXE亚族全部成员基因和大鳞副泥鳅DMRT1基因,并利用半定量RTPCR和荧光定量RTPCR对各个基因的表达模式进行了研究,为了更进一步确定目的基因的表达部位,我们利用RNA原位杂交法分别对两种泥鳅的性腺和不同发育时期的胚胎进行了杂交,主要研究结果包括下面三个方面1泥鳅SOXE亚族基因的克隆和表达模式分析本研究根据其它物种SOX8和SOX10基因HMG保守区序列,设计两对简并引物,并在此基础上采用RACE方法从泥鳅脑中分离得到了SOXE亚族各成员CDNA全序列MASOX8A基因CDNA全长为2555BP,包括53BP5非翻译区,1212BP3非翻译区含POLYA和编码429个氨基酸的开放阅读框基因注册号为GU166139MASOX8B基因CDNA全长为1725BP,包括85BP5非翻译区,395BP3非翻译区含POLYA和编码414个氨基酸的开放阅读框基因注册号为GU166140MASOX9A基因CDNA全长为3192BP,包括326BP5非翻译区,1408BP3非翻译区含POLYA和编码485个氨基酸的开放阅读框MASOX9B基因的CDNA全长为1782BP,包括217BP5非翻译区,179BP3非翻译区含POLYA和编码462个氨基酸的开放阅读框MASOX10基因的CDNA全长为2096BP,包括311BP5非翻译区,312BPY非翻译区含POLYA和编码490个氨基酸的开放阅读框。半定量RTPCR和荧光定量RTPCR结果显示在泥鳅胚胎发育的各个时期,MASOX8A和MASOX8B的表达趋势相反但是都从原肠胚开始一直持续到卵黄吸尽期,MASOX9A和MASOX9B的表达量都逐渐升高,在孵出期期表达量最高,MASOX10的表达量逐渐增加,孵出期达到最高在泥鳅成体的不同组织中,SOXE亚族各个基因都广泛存在,MASOX8A和MASOX8B在脑中的表达量较高,MASOX9A和MASOX9B在性腺中表达量最高,SOX10在心脏中表达量最高。原位杂交试验结果显示SOXE亚族的五个成员都在泥鳅未成熟的生殖细胞卵巢的卵原细胞、初级卵母细胞,精巢中的精原细胞和精母细胞中表达,因此推测SOXE亚族的五个成员可能调控泥鳅性腺的发育和分化整体胚胎杂交发现,SOXE亚族的五个成员均在体节形成期的体节中大量表达,之后一直到尾芽期的胚胎脊柱中都有很强的阳性杂交信号,孵出期以后SOXE亚族的五个成员的表达主要集中在泥鳅的脊柱、体节和头部。2大鳞副泥鳅SOXE亚族基因的克隆和表达模式分析本研究根据其它物种SOX8和SOX10基因HMG保守区序列,设计两对简并引物,并在此基础上采用RACE方法从泥鳅脑中分离得到了SOXE亚族各成员CDNA全序列PDSOX8A基因CDNA全长为2467BP,包括53BP5非翻译区,1127BP3非翻译区含POLYA和编码428个氨基酸的开放阅读框PDSOX8B基因CDNA全长为2166BP,包括201BP5非翻译区,720BP3非翻译区含POLYA和编码414个氨基酸的开放阅读框PDSOX9A基因CDNA全长为3232BP,包括329BP5非翻译区,1439BP3非翻译区含POLYA和编码487个氨基酸的开放阅读框PDSOX9B基因的CDNA全长为1946BP,包括219BP5非翻译区,341BP3非翻译区含POLYA和编码461个氨基酸的开放阅读框PDSOX10基因的CDNA全长为2053BP,包括312BP5非翻译区,262BP3非翻译区含POLYA和编码492个氨基酸的开放阅读框。半定量RTPCR和荧光定量RTPCR结果显示在大鳞副泥鳅胚胎发育的各个时期,PDSOX8A、PDSOX8B、PDSOX9B和PDSOX10的表达量都逐渐下降,PDSOX9A的表达量则相反呈现上升趋势在大鳞副泥鳅成体的不同组织中,SOXE亚族各个基因中广泛存在,并且都在性腺中大量表达,除此之外PDSOX8A在脑中的表达量也很高,PDSOX8B、PDSOX9A和PDSOX9B在肝中的表达量均较高,PDSOX10在心脏中表达量高。SOXE亚族的五个成员在大鳞副泥鳅性腺和胚胎中的原位杂交试验结果与泥鳅的一致。3大鳞副泥鳅DMRT1基因的选择性剪接和时空表达模式分析本研究根据其它物种DMRT1基因DM保守区序列,设计一对简并引物,并在此基础上采用RACE方法获得了大鳞副泥鳅DMRT1基因的CDNA全长。结果表明在大鳞副泥鳅中DMRT1基因存在选择性剪接。大鳞副泥鳅中得到五条DMRT1基因,分别命名为PDDMRTLA11903BP、PDDMRTLA21714BP、PDDMRTLA3887BP、PDDMRTLB724BP和PDDMRTLC946BP,它们也都含有DM基序和POLYA尾。其中PDDMRTLA1～3具有相同的开放阅读框,包含5个完整的外显子,编码267个氨基酸,其差异主要在于3非翻译区长度和序列不同PDDMRTLB缺失了第四个外显子3末端的9BP和第五个外显子,编码220个氨基酸PDDMRTLC则同时缺失了第四和第五个外显子,并利用一段长63BP的额外序列在其编码框末端充当第五个外显子,编码196个氨基酸。半定量RTPCR、荧光定量RTPCR和原位杂交技术用于检测大鳞副泥鳅DMRT1基因在成体不同组织和胚胎发育不同时期的表达谱。结果表明大鳞副泥鳅DMRT1基因只在精巢中强烈表达,而在卵巢中不表达或只有极微弱表达,这与其它物种中的研究结果相一致在胚胎发育的各个时期大鳞副泥鳅DMRT1基因均有表达,但表达强度又各不相同,呈现先上升后下降的表达趋势。由此,推断大鳞副泥鳅的DMRT1与雄性性腺分化和发育具有明显的相关性。这些结果为阐述DMRT1在脊椎动物体内对性别决定和性别分化的作用奠定了基础。综上所述本研究结果证明1两种泥鳅SOXE亚族至少由五个成员组成SOX8A、SOX8B、SOX9A、SOX9B和SOX102本实验首次发现在两种泥鳅中SOX8基因都具有两个亚型SOX8A和SOX8B,目前仅发现河豚SOX8基因具有以上两种亚型,其它物种中未见到相关报道3两种泥鳅中SOX9基因也都具有两个拷贝SOX9A和SOX9B,而SOX10基因只存在一个拷贝,这与部分己报道的物种一致4我们发现大鳞副泥鳅的DMRT1基因存在选择性剪接5本实验首次利用多种检测方法对各个目的基因的表达模式进行了系统研究。SOXE亚族各成员之间存在功能冗余,它们对两种泥鳅神经系统和生殖系统的分化具有重要作用DMRT1基因可能是一个与精巢的形成和精巢的功能维持有关的性别分化基因。